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解決PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)假陰性或無擴(kuò)增產(chǎn)物
點擊次數(shù):1655 更新時間:2022-05-23

解決PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)假陰性或無擴(kuò)增產(chǎn)物(即陽性對照中有條帶,而樣品則無條帶)方法:

  1、條帶放置時間過久,核酸被降解,最好在48h內(nèi)進(jìn)行電泳檢測。

  2、DNA模板純度低,如含有雜蛋白質(zhì)或Taq酶抑制劑,可對DNA進(jìn)行再次純化或重新用優(yōu)質(zhì)試劑盒提取DNA; DNA濃度太低時,可以加大模板量;對具有二級結(jié)構(gòu)DNA使用較好的聚合酶;提取DNA時,避免吸入酚類試劑。

  3、對設(shè)計不合理的引物進(jìn)行重新設(shè)計合成;引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,防止多次凍融而降解失效;檢測引物OD值并進(jìn)行電泳檢測以確保兩條引物濃度一致。

  4、酶失活時,更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。

  5、PCR反應(yīng)條件:提高變性/退火溫度;適當(dāng)增加循環(huán)次數(shù)。

  6、Mg2+濃度過低可影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗,而Mg2+濃度過高會降低PCR的特異性,因而可適當(dāng)提高M(jìn)g2+濃度。

  7、如果靶序列發(fā)生突變或缺失時,也會影響引物和模板的特異性結(jié)合,產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

  Q3:非特異性條帶擴(kuò)增或者條帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象

  Answer:

  1、當(dāng)引物特異性差或引物形成二聚體時,可重新設(shè)計引物或者使用巣式PCR

  2、若模板或引物濃度過高,可適當(dāng)降低模板或引物濃度

  3、酶量過多,則適當(dāng)減少酶量

  4、Mg2+濃度偏高,則降低鎂離子濃度

  5、退火溫度偏低,適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法(94變性,65左右退火與延伸)

  6、循環(huán)次數(shù)過多,不僅會降低擴(kuò)增效率,且會使錯誤摻入率增加,因此需要減少循環(huán)次數(shù)。


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